L'Emofilia A

L’emofilia è una malattia emorragica ereditaria dovuta all’assenza, diminuzione o alterata funzione del FVIII. L’incidenza è di 20 casi ogni 20.000 nati maschi ed è trasmessa col cromosoma X in forma recessiva.

Le alterazioni genetiche consistono in mutazioni puntiformi, a delezioni o a mutazioni che comportano la formazione di un codone di stop : in tale ultimo caso sembra implicato il codone arginina (CGA) che determina così una grave anomalia molecolare con FVIII:Ag non dosabile. Sono state comunque identificate moltre altre mutazioni puntiformi che determinano anomalie funzionali del fattore con ampia variabilità clinica; in sintesi le anomalie possono essere quantitative o qualitative (5%).

Accanto a tutte le possibili combinazioni  genetiche è da tener conto della possibilità di comparsa sporadica della malattia per mutazioni puntiformi. La diagnosi di portatrice può essere posta sulla base di valutazioni di tipo anamnestico e dosaggio del FVIII; la diagnosi prenatale dalla biopsia dei villi coriali tra la 10 e 12 settimana di gestazione.

Il FVIII è una glicoproteina che circola in minima quantità nel plasma (0.1-0.2 ng/ml) con emivita di circa 12 ore legata ad una glicoproteina a struttura multimerica (von Willebrand factor); possiede due attività funzionali : FVIIIC implicato nell’emofilia che è attivato da basse concentrazioni di trombina e inattivato da alte concentrazioni; FVIIIAg che risulta essere la proteina vettrice dei determinanti antigenici e non viene influenzata dalla trombina. Il FVIII è un cofattore  plasmatico della coagulazione (insieme al FV) ed interviene nell’attivazione del FX-àFXa da parte del FIXa; per fare questo è necessario che esso stesso sia attivato da  piccole tracce di trombina.

Struttura e funzione

La funzione del FVIII nella via intrinseca della coagulazione è quella di cofattore nell’accelerare l’attivazione del FX da parte del FIX su una superficie fosfolipidica ed in presenza di Ca+. Studi sperimentali hanno evidenziato che la molecola del FVIII è sintetizzata in singola catena polipeptidica contenente delle strutture denominate domains A1-A2-B-A3-C1-C2 e dopo secrezione dalla cellula è processata  in eterodimero consistente in una catena leggera carbossiterminale di 80 kDa  legata ad una catena pesante aminoterminale di 200 kDa. La struttura in domini del FVIII è identica a quella del suo omologo FV: vi sono analogie nelle sequenze aa che arrivano al 40% tra i due fattori. Nel plasma la catena leggera del FVIII è legata da legami non-covalenti al sito primario di interazione con l’amino terminale del vWF. L’osservazione che l’Emofilia A offre protezione ad eventi cardioischemici e che elevati livelli di FVIII sono associati a eventi tromboembolici incentiva studi sui suoi meccanismi di regolazione. Benchè un monomero di vWF leghi una molecola di FVIII il rapporto di associazione tra i due, in vivo è di 1: 50 ; ogni variazione plasmatica di vWF è associata ad una variazione dei livelli di FVIII. L’infusione di vWF in pz carenti di vWF incrementa i livelli di FVIII allo stesso modo dei soggetti normali; la presenza di vWF aumenta l’emivita plasmatica del FVIII da 2-3 h a 12-14 h. Studi in vitro hanno dimostrato che il vWF regola l’atticità del FVIII attraverso meccanismi aggiuntivi :

·         Il vWF impedisce l’attivazione del FVIII da parte del FIX ma non da parte della trombina.

·         Il vWF impedisce l’inattivazione del FVIII da parte della aPC.

·         Il vWF impedisce il legame del FVIII ai fosfolipidi ed alla trombina attivata piastrine.

Benchè il sito primario di interazione tra il FVIII ( res.1680-1689 e C2 domain) ed il vWF (res.1-272) siano stati identificati, i siti  delle interazioni suddette non sono stati ancora identificati.

 In vivo l’attività del FVIII è regolata da attivazione e inattivazione proteolitica. La trombina aumenta di circa 30 volte l’attività procoagulante del FVIII; l’attivazione coincide con la proteolisi di entrambe le catene leggera e pesante del FVIII ed il rilascio dal vWF. Il clivaggio dentro la catena pesante genera un polipeptide di 90 kDa e successivamente due polipeptidi di 50  e 43 kDa; contemporaneamente la catena leggera di 80 kDa è clivata per dar vita adun polipeptide di 73 kDa. In conclusione l’attivazione trombinica genera un eterotrimero formato da tre frammenti  di 50, 43 e 73 kDa.

Il FVIII ed il FVIIIa sono entrambi inattivati dalla aPC che cliva i residui 336 e 562 sui due frammenti più piccoli e tale meccanismo, come risaputo, è di estrema importanza nell’economia della bilancia emostatica.

Diversi studi supportano la conclusione che la perdita dell’attività coagulante dopo attivazione trombinica è dovuta ad una reversibile dissociazione del frammento di 43 kDa dell’A2 domain: la specifica attività del FVIII porcino è 2 – 10 volte maggiore del FVIII umano e ciò correla da un più basso rapporto di dissociazione dell’ A2 domain.

Sulla base di queste ed altre conoscenze la prospettiva di studio dell’ingegneria genetica è quella di “costruire” molecole di FVIII migliorate agendo su alcuni punti :

·         Modificazioni che migliorano l’espressione del FVIII ( FVIII con domain B parzialmente deleto denominato REFACTO ) i cui potenziali benefici sono : 1- la formulazione senza albumina 2- costruzione di molecola più piccola per cui minor volume 3- uso in profilassi

·         Modificazioni che aumentano l’emivita del FVIII riducendo così somministrazioni e costi.

·         Modificazioni che riducono l’immunogenicità del FVIII onde evitare lo sviluppo di inibitori: diversi studi hanno dimostrato che i più comuni epitopi che inducono sviluppo di inibitori sono localizzati nell’A2 domain e C2 domain.

·         Sviluppo di composti attivi per via orale. Intal senso sono interessanti gli studi che hanno identificato i cambi conformazionali che alcune parti della molecola del FVIII determinano sul FIX: i domain A3-C1 e C2 (catena leggera) agganciano i fosfolipidi e l’EGF (epidermal growt-factor like) del FIX mentre l’A2 domain determina un cambio conformazionale del sito serin-proteasi del FIX che si lega col suo domain  GLA (gamma carbossil glutammic acid) ai fosfolipidi di membrana. In tal modo è possibile ricavare peptidi “small” attivi per via orale che simulano tale azione.

Clinica

La malattia presenta una vasta etereogeneità  per le diverse anomalie molecolari; sulla base dell’attività dell’FVIIIC riferita ad uno standard (100%  = 1 U/ml di FVIII); in un soggetto normale l’FVIIIC oscilla tra 0.5 – 2.0 U/ml (= 50 – 200%) per cui si considera E. grave per valori < 1%, moderata 1-4% e lieve 5-25%.

Ematomi – Emartri – Ematuria – Compl. Neurologiche – cisti ossee e pseudotumori…..

Laboratorio

PT e Plt nella norma . aPTT allungato secondo la gravità.

Valutazione FVIIIC cimentando plasma in esame con plasma depauperato di FVIII.

Valutazione FVIIIAg mediante metodo immunologico.

Dal raffronto tra questi due ultimi dosaggi è possibile esprimere un giudizio di carenza quantitativa e/o difetto qualitativo della molecola .

 Terapia

La terapia dell’E. GRAVE è sostitutiva e consiste nella somministrazione del fattore carente  in quantità e frequenza tali da raggiungere il livello plasmatico voluto in ragione della gravità e sede dell’emorragia. I livelli  minimi di FVIIIC da raggiungere sono 30% (0.30Uml) per le emorragie lievi e del 50% (0.50U/ml) per gli emartri, emorragie muscolari  e comunque gravi; per le emorragie cerebrali occorre l’80-100%(1.0U/ml). Uno schema molto pratico è il seguente : 1 U di FVIIIC infuso /Kg innalza del 2% (0.02U/ml) l’FVIIIC.

 Formula   =  livello desiderato (%) :2 * Kg del pz.

 PRESIDI TERAPEUTICI

 ·         Concentrati di FVIII da pool di donatori liofilizzati, pasteurizzati e trattati al calore.

·         Concentrati di FVIII porcino.

·         FVIII ricombinante.

·         FVII ricombinante.

 Circa il 15% dei pz emofilici sviluppa senza apparente causa Ab anti FVIII (IgG); il rischio di sviluppare Ab aumenta con il numero di trasfusioni fino ad un plateau di 50-100 quindi diminuisce. Una volta comparso l’inibitore il titolo scende se non si espone più il pz a infusioni fino a essere indosabile; la riesposizione all’infusione di FVIII divide i pz in 2 categorie : LOW responders e HIGH responders secondo se la risposta anamnestica è < o > di 10 U Bethesda. Il sospetto clinico della comparsa di Ab si deve avere quando c’è una ridotta efficacia della terapia, in tal caso occorre procedere alla miscela 1:1 tra plasma in esame e plasma normale; il dosaggio degli inibitori viene eseguito secondo il metodo “Bethesda” che consiste nell’incubare a 37° per due ore miscele diverse di plasma normale e plasma del pz; la miscela che mostra un’attività pari al 50% contiene 1 U Bethesda di inibitore /ml; il titolo equivale al reciproco della diluizione contenente 1UB.

 TRATTAMENTO DEGLI INIBITORI

La comparsa di inibitori è attualmente la complicanza più temibile e la più difficile da trattare. Nei “low” con UB < 5U sono sufficienti alti dosaggi di FVIII per sopraffare gli Ab. Negli “high” tale comportamento è addirittura dannoso per cui a parte vari tentativi con immunosoppressori, plasmaferesi e IgHD con  scarsi risultati  gli unici presidi validi rimangono il FEIBA (Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity) o Complesso Protrombinico attivato e il FVII ricombinante.

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Ultimo aggiornamento: 28 marzo 2005